D'après Beugnet et al. Abrégé de Parasitologie clinique du chien et du chat, 2021
Flottation simple (par gravité) - Méthode de Mc Master - Flottation avec centrifugation - Techniques FLOTAC
Flottation simple (par gravité)
Exemple de méthode : une petite quantité de fèces (environ 3 g) est déposée dans un gobelet ou un bécher de 90 ou 150 mL avant d’y ajouter 20 mL de solution de flottaison. La solution et les fèces sont ensuite soigneusement mélangées à l’aide d’une baguette (comme un abaisse-langue) jusqu’à l’obtention d'une émulsion homogène. Ce mélange de fèces et de solution de flottaisonF est filtré au travers d’une double couche de compresses ou de gaze. On peut également utiliser une passoire à thé. Le filtrat est ensuite versé dans un tube qui doit être rempli à ras bord, jusqu’à l’obtention d'un ménisque convexe à la surface du tube. S’il n’y a pas assez de mélange dans le bécher pour remplir le tube, il est possible d’ajouter un peu de liquide de flottation frais.
Une lamelle couvre-objet est alors délicatement posée au-dessus du liquide et maintenue dans cette position pendant 10 à 20 minutes. La lamelle est ensuite retirée avec soin et immédiatement déposée sur une lame pour un examen au microscope.
Des kits complets sont commercialisés. Ces kits contiennent la solution de flottaison prête à l’emploi, des flacons en plastique à usage unique et des tamis.
Avantages
Méthode peu coûteuse et facile à mettre en œuvre.
Inconvénients
La lame doit être examinée rapidement car la distorsion osmotique peut rendre les éléments parasitaires difficiles à identifier. Le milieu peut aussi cristalliser et obscurcir le champ du microscope. Les œufs de trématodes peuvent être trop denses et ne pas remonter, ou être déformés à cause de l’effet hypertonique exercé par la solution de flottaison, en raison de sa densité très élevée.
Méthode de Mc Master
Cette méthode est très utilisée chez les grands animaux, essentiellement pour la détection et le comptage des œufs de strongles. De nombreuses variantes de la méthode de Mc Master ont été décrites dans la littérature. Toutes utilisent le dispositif classique à deux chambres.
Les méthodes de flottation sont toujours qualitatives, à moins d’utiliser une quantité connue de fèces. Toute méthode, même gravitationnelle, peut devenir quantitative si l’échantillon de fèces est pesé avant d’être préparé. Il existe plusieurs méthodes dont le protocole indique la quantité de fèces à utiliser. Le mode opératoire est le suivant :
Méthode de Mc Master modifiée
Trois grammes de fèces sont déposés dans un récipient, qui est rempli de solution de flottaison jusqu’à 45 mL, ce qui correspond à une dilution de 1/15. La solution et les fèces sont ensuite soigneusement mélangées jusqu’à l’obtention d’une émulsion homogène. Le mélange est ensuite filtré au travers d’un tamis. Le filtrat récupéré est bien homogénéisé, puis prélevé à l’aide d’une pipette Pasteur et soigneusement déposé dans une des chambres de la cellule de Mc Master. Après avoir de nouveau agité le filtrat, un second prélèvement est déposé dans l’autre chambre.
Tous les œufs sont ensuite comptés sous chacune des deux grilles. Le volume observé sur chaque grille est de 0,15 mL. Le nombre d’oeufs par gramme de fèces est obtenu en multipliant le nombre d'œufs comptés sous les deux grilles par 50 (le facteur de dilution). Si le rapport entre les fèces et la solution de flottaison change, le facteur de dilution est modifié.
Méthode de Mc Master améliorée
Là aussi, 3 g de fèces sont mélangés avec de l’eau pour obtenir un volume de 45 mL, qui est filtré au travers d’une grille métallique. Un échantillon du filtrat homogénéisé est versé dans un tube à centrifuger jusqu’à 10 mm du haut du tube. Le tube est centrifugé pendant 2 minutes à 170 g puis le surnageant est éliminé. Le tube est ensuite rempli de solution de flottaison jusqu’au niveau initial.
L’ensemble est soigneusement mélangé et un volume suffisant de liquide est immédiatement prélevé avec une pipette Pasteur et délicatement déposé dans une des chambres de comptage. Après une nouvelle homogénéisation du liquide, la seconde chambre est remplie. Tous les œufs sont comptés sous chacune des deux grilles.
Avantages
De nombreux auteurs considèrent qu’il s’agit de la méthode quantitative la plus simple.
Inconvénients
La dilution peut réduire la sensibilité de l’analyse lorsque les éléments parasitaires sont peu nombreux. Une quantité non négligeable de liquide est éliminée car les fèces sont mélangées avec une solution de flottaison, mais seul un petit volume du mélange est déposé sur les lames.
Flottation avec centrifugation
De nombreuses méthodes de centrifugation suivie de flottation ont été décrites, chacune ayant ses propres avantages et inconvénients. Quelques-unes des méthodes de flottation avec centrifugation les plus utilisées sont décrites ci-dessous.
Technique Wisconsin
Trois à 5 g de fèces sont déposés dans un récipient en polypropylène et mélangés avec 25 mL d’eau. Un abaisse-langue est utilisé pour homogénéiser l'échantillon. L’échantillon est ensuite versé sur une passoire à thé et le filtrat récupéré dans un autre récipient. Le premier récipient et la passoire sont rincés avec 8 mL d’eau. Tout le liquide est alors versé dans deux tubes à centrifuger à fond conique de 15 mL, puis centrifugé à 150 g pendant 10 minutes.
Le surnageant est décanté en prenant soin de ne pas perdre le fin sédiment du culot de centrifugation. La solution de flottaison est ensuite ajoutée jusqu’à remplir les tubes à la moitié et le culot de centrifugation est remis en suspension à l’aide d’une baguette. Les tubes sont complétés à ras bord avec de la solution de flottaison jusqu’à la formation d’un ménisque légèrement convexe, qui est couvert d’une lamelle de 22 x 22 mm. Les échantillons sont ensuite centrifugés comme précédemment. Les lamelles couvre-objet sont retirées, déposées sur les lames et examinées.
Méthode de double centrifugation modifiée (méthode Cornell-Wisconsin)
Un à 5 g de fèces (5 g dans la description originale) sont mélangés avec 10 à 12 mL d’eau, puis le mélange est versé sur une passoire à thé et le filtrat récupéré dans un bécher. Le récipient ayant servi au mélange est rincé avec 2 ou 3 mL d’eau, puis filtré à son tour. La matière humide contenue dans la passoire est pressée à l’aide d'une spatule pour extraire autant d’eau que possible avant d’être éliminée. Les fèces filtrées sont placées dans un tube à centrifuger conique de 15 mL et centrifugées à 150 g pendant au moins 3 minutes (certains ouvrages recommandent 5 à 10 minutes). Le surnageant est éliminé, en prenant soin de ne pas perdre le fin sédiment. Le tube est rempli à la moitié environ avec la solution de flottaison et le sédiment est remis en suspension à l’aide d’une baguette. Le tube est ensuite rempli à ras bord avec la même solution de flottaison. La solution doit arriver jusqu’au bord du tube (en formant un ménisque légèrement convexe). Une lamelle de 22 x 22 mm est ensuite placée au-dessus du tube, en veillant à ce qu’elle soit en contact avec la solution de flottaison et le bord du tube. Le tube est alors centrifugé pendant 5 minutes comme précédemment. La lamelle est ensuite retirée et déposée sur une lame pour l’examen.
Avantages
Le seuil de détection est d’un élément parasitaire pour 1–5 g de fèces. L'étape de lavage à l’eau aide à éliminer les substances très légères, pour faciliter la lecture des préparations.
Inconvénients
Étant donné qu’elle compte deux étapes, la technique est un peu plus longue que celles utilisant une seule centrifugation.
Techniques FLOTAC
Ces techniques font appel à un appareil FLOTAC et reposent sur la centrifugation et la flottation d’une suspension fécale puis le transfert de la partie apicale du produit de flottation.
Trois méthodes peuvent être employées avec le dispositif FLOTAC (de base, dual et double), qui sont toutes des variantes d'une même technique, mais dont les applications diffèrent.
La technique de base nécessite une seule solution de flottaison. Elle est recommandée pour les échantillons fécaux contenant peu ou très peu d’élément parasitaire d’une seule espèce (mono-parasitisme naturel ou expérimental), ou ceux contenant peu ou très peu d’élément parasitaire de types variés, qui se comportent tous de la même façon dans la solution de flottaison employée. Les unités de référence de la technique de base sont les deux chambres de flottation de l’appareil FLOTAC (volume total de 10 mL, correspondant à 1 g de fèces). La sensibilité de cette première technique est d’1 élément parasitaire par gramme de fèces.
La technique dual du dispositif FLOTAC repose sur l’utilisation en parallèle de deux solutions de flottaison différentes aux densités complémentaires, sur un même échantillon fécal. Cette technique est indiquée pour les enquêtes épidémiologiques et les examens de routine, visant à dépister une grande variété d’élément parasitaire réagissant différemment dans les solutions de flottaison. Pour cette technique, l’unité de référence est la chambre de flottation (volume de 5 mL, correspondant à 0,5 g de fèces). Sa sensibilité est de 2 élément parasitaire par gramme.
La technique double correspond à l’examen simultané de deux échantillons fécaux différents, provenant de deux hôtes différents, au moyen d'un seul appareil FLOTAC. Avec cette technique, chacun des deux échantillons fécaux est analysé dans une seule chambre de flottation, en utilisant la même solution de flottaison. L’unité de référence est donc la chambre de flottation (volume de 5 mL, correspondant à 0,5 g de fèces). La sensibilité de la technique double du dispositif FLOTAC est de 2 élément parasitaire par gramme.
Le protocole est le suivant : chaque échantillon de fèces est dilué dans de l’eau du robinet (dilution au 1/10). Après homogénéisation (il est recommandé d’utiliser un mixeur plongeant), la suspension est filtrée au travers d'un tamis métallique (maillage = 250 µm), puis 6 mL de la suspension filtrée sont transférés dans des tubes coniques. Les tubes sont centrifugés à température ambiante pendant 3 minutes à 170 g, puis chaque surnageant est éliminé, en ne laissant que le sédiment (culot) dans les tubes. Chaque tube est ensuite rempli avec la solution de flottaison choisie jusqu’au niveau initial (6 mL). Les suspensions sont soigneusement homogénéisées (avant et après le remplissage) et les deux chambres de flottation de l’appareil FLOTAC sont remplies. Le FLOTAC est ensuite fermé et centrifugé pendant 5 minutes à 120 g, à température ambiante. Après la centrifugation, la rotation simultanée à 45° du disque de transfert et du disque de lecture de l’appareil coupe (retire) la partie supérieure de la suspension dans les deux chambres (= transfert) et le disque de lecture est examiné au microscope.
Avantages
Le volume de suspension fécale analysée étant important, les faux négatifs sont moins fréquents. Le dispositif FLOTAC est particulièrement indiqué lorsque les éléments parasitaires sont peu nombreux. La lecture des résultats est aisée.
Inconvénients
La mise en œuvre requiert un certain niveau d'équipement (par exemple, centrifugeuse de grande capacité ou centrifugeuse de paillasse avec rotor pour plaques de microtitrage) dont les structures vétérinaires ne disposent pas toujours.
Cette technique demande plus de temps que d’autres techniques de flottation.
Mini-FLOTAC
Le Mini-FLOTAC a été développé pour répondre aux besoins des structures disposant d’un équipement limité, en supprimant l’étape de centrifugation. Il est recommandé d’utiliser le Mini-FLOTAC avec le Fill-FLOTAC, un kit de prélèvement à usage unique, qui comprend un récipient, un collecteur et un filtre. Le Fill-FLOTAC permet de simplifier les quatre premières étapes de la technique : recueil et pesée de l'échantillon, homogénéisation, filtration et remplissage.
Deux grammes de fèces fraîches sont pesés dans un récipient, dans lequel on ajoute ensuite la solution de flottaison pour obtenir un volume total de 20 mL (dilution au 1/10). La suspension est soigneusement homogénéisée, puis filtrée au travers d’un tamis métallique (maillage = 250 µm). Le filtrat est ensuite mélangé et les deux chambres du Mini-FLOTAC remplies (ces quatre étapes peuvent être réalisées dans le Fill-FLOTAC). Après 10 minutes d'attente, la partie supérieure de chacune des chambres de flottation du Mini-FLOTAC est transférée et examinée au microscope. La sensibilité de la technique de base du Mini-FLOTAC est de 5 élément parasitaire par gramme.
Avantages
Le système est fermé et l’analyse peut être effectuée à partir d’échantillons fixés. Il peut être utilisé à la place du FLOTAC par les laboratoires ne disposant pas d'une centrifugeuse adaptée. Le Mini-FLOTAC a été validé en parasitologie vétérinaire pour le diagnostic des helminthoses des animaux de compagnie et de rente (par exemple, ascarides, ankylostomes, trichures, nématodes gastro-intestinaux).
Inconvénients
Le seuil minimal de détection de 5 élément parasitaire par gramme n’est pas toujours suffisant.